摘要

消毒劑能有效抑制或殺死微生物，消毒劑在我國的家畜、家禽、水產和食用真菌的養殖業中廣為應用。本文綜述了近年來微生物對消毒劑耐藥性的研究，從消毒劑耐藥性定義切入，著重從微生物通過形成生物膜、借助外排泵系統、產生相關特異性酶、改變靶點、降低細胞膜、壁通透性等方式產生抗性的機制進行綜述，同時論述了實驗室常用微生物耐藥性檢測方法及耐藥性控制措施，利用措施盡可能減小消毒劑耐藥性的影響。

關鍵詞

消毒劑 耐藥機制 生物膜  耐藥檢測 控制措施

消毒劑是一類可用于物體表面以及空氣、水等傳播介質中抑制或殺死微生物的化學物質，科學合理使用消毒劑能有效切斷病原微生物傳播途徑，但長期不合理地使用消毒劑會降低其有效性，甚至會誘導微生物產生抗性^[1]。

消毒劑的耐藥性定義為細菌對常用濃度的消毒劑敏感性下降，即消毒劑在常規的作用濃度和時間下，不能將細菌有效抑制或者殺滅，這種抗性與消毒劑對某微生物的作用濃度、作用時間等有關^[2,3]。細菌與消毒劑多次接觸后，使該類消毒劑的最小抑菌濃度或最小殺菌濃度 (MIC或MBC)升高的現象^[4]。

消毒劑由于長期或過量使用，經稀釋殘留進入環境，可能對環境微生物生態多樣性產生影響。微生物會通過表型適應、基因突變和水平基因轉移等方式提高對消毒劑的耐受性或產生抗性基因。微生物消毒劑性抗基因的獲得和轉移可由染色體介導，也可由質粒介導。一般來說，染色體介導的抗性基因主要通過傳代過程垂直傳播或者同種間傳播，而質粒介導的抗性更容易引發抗性基因在不同種屬間的水平轉移而增加抗性及抗性基因的傳播風險^[1]。

圖1.消毒劑抗性基因及轉移傳播方式示意圖^[1]

1、消毒劑耐藥性分類

消毒劑抗性產生的機制包括天然耐藥和獲得性耐藥等多個方面。天然耐藥主要是由于細菌本身的生化結構造成的，受染色體控制的特性。某些菌株由于具有特殊的生化結構，從而起到消毒劑屏蔽作用，產生天然耐藥，如外膜蛋白、脂多糖等^[2,4]。固有性耐藥在微球菌和革蘭陰性菌中更為常見^[5]。

獲得耐藥性是指細菌通過非固有遺傳性狀而獲得的耐藥性^[5]，細菌通過獲得質粒、轉座子或發生基因突變而產生對消毒劑的耐藥性，使其不被消毒劑殺滅，質粒介導的耐藥性的獲得為主要途徑，細菌的獲得性耐藥可因不再接觸消毒劑而消失，也可由質粒將耐藥基因轉移給染色體而代代相傳^[4]。

圖2. 耐藥性基因遺傳和表型^[6]

在一定環境和選擇壓力下，消毒劑抗性微生物的抗性基因可通過垂直和水平轉移迅速傳播，一方面會降低消毒劑的消毒效率；另一方面，這種基因污染物可能對生態環境和人類健康構成嚴重威脅。在實際環境中，微生物可能會利用多種機制策略抵抗消毒劑作用^[1]。

2、微生物對消毒劑耐藥機制

細菌耐藥機制復雜，往往是多種耐藥機制同時存在或者協同作用。根據目前研究，微生物消毒劑抗性機制基本可分為為形成生物膜、借助外排泵系統、產生相關特異性酶、改變靶點、降低細胞膜、壁通透性等。如圖3所示：

圖3. 消毒劑耐藥性機理類型^[1]

2.1 形成生物膜耐藥機制

微生物多糖包被分泌物和胞外聚合物將自身包繞形成生物膜產生對消毒劑的耐藥性^[1]。生物膜阻礙消毒劑的有效擴散，并與消毒劑產生交互作用，影響消毒劑與細菌的接觸，而表現出耐藥性。細菌形成BF（生物膜）的糖被會阻擋消毒劑進入細胞，糖被是一種聚陰離子聚合物，在生物膜中具有離子交換樹脂的作用，當置于消毒劑中，糖被會吸收大量的消毒劑分子，使得消毒劑分子的擴散受影響，活性分子不能進入細胞和靶位點作用，從而保護生物膜中細菌免受作用^[7]。如單核細胞增生李斯特菌在過氧乙酸處理后，容易形成靜態和連續流動生物膜，并對苯扎氯銨和過氧乙酸消毒劑的抗性增高。分析發現消毒劑的使用促使與形成生物膜和抗性相關的熱激響應轉錄因子hrcA和分子伴侶dnaK表達增加，從而產生抗性。用乙醇處理金黃色葡萄球菌后，與生物膜形成相關的基因icaA和icaD轉錄水平顯著提高，這些基因的表達有助于細胞間多糖黏附素生成而形成生物膜^[1]。銅綠假單胞菌和熒光假單胞菌可誘導磷酸鹽降解、脂質生物合成和多胺生物合成的調節因子，有助于提高生物膜的抵抗力和恢復力，產生對戊二醛的抗性。

2.2 借助外排泵系統實現耐藥性

一些抗性微生物面對消毒劑的威脅時，通過外排泵外排策略快速、有效地減少細胞內的消毒劑劑量，從而實現抗性^[1]。細菌外排泵是指位于細菌細胞膜上具有特殊結構且需要能量運行的一類轉運蛋白，主要由外膜通道蛋白、融合蛋白、外排蛋白三部分組成，并且外排泵系統的類型十分復雜。如qacE是屬于小多重耐藥家族(SMR)的外排泵基因，其編碼對季銨鹽類消毒劑具有外排作用的外排泵從而導致對該類消毒劑的的耐藥性。氯己定的外排泵基因可以明顯的增加氯己定的MIC值，降低氯己定的殺菌效果^[3]。沙門菌對季銨鹽消毒劑的耐藥性是由于位于沙門菌多重耐藥質粒的qacEΔ1基因的編碼蛋白屬跨膜蛋白，依靠質子運動力反向轉運，主動將消毒劑自菌體細胞排出^[8]。苯酚及其類似物如三氯生，這類消毒劑的耐藥機制有著本身所具有的特點，細菌可以通過消毒劑的滅活作用改變靶點和外排泵介導產生對消毒劑的耐藥性^[1,3]。

2.3 產生相關特異性酶形成耐藥機制

通過產生滅活酶或鈍化酶等特異性酶作用，使消毒劑的作用減輕或者消除。微生物面對消毒劑的作用可能產生具有特定功能的酶，調節自身，增強對消毒劑的耐受性，一些分子伴侶、調節蛋白、輔酶因子等也在其中起到輔助作用^[1]。此外，細菌的耐藥基因可產生某些酶，使消毒劑降解而表現出耐藥性^[4]。如微生物可以分泌乙醛脫氫酶水解醛類，甲醛脫氫酶可催化醛的歧化反應，大多依賴谷胱甘肽和輔酶發揮降解作用，可以協助惡臭假單胞菌降解甲醛、乙醛、丙醛等醛類消毒劑；過氧化氫酶和過氧化物歧化酶可以分解氧化型殺菌劑^[1]。

2.4 改變作用靶點產生耐藥性

微生物可以通過在結合位點或結合位點附近進行突變或酶修飾，使靶點發生物理改變，從而減少與消毒劑的結合^[1]。如大腸埃希菌和單核增多李斯特菌可以改變作用靶點對三氯生產生耐藥性等^[1,3]。三氯生在大腸桿菌中的耐藥性就是由于編碼脂肪酸合成中的enoyl酰基載體蛋白還原酶FabI基因發生了突變，使得三氯生無法結合FabI酶而發揮殺菌作用，因此菌體產生了耐藥性。 

2.5 降低細胞膜、壁通透性產生耐藥性

一些微生物可通過降低細胞膜、細胞壁通透性，減少或阻止消毒劑進入微生物細胞內，提高對消毒劑的抗性。細菌細胞表面攜帶負電荷，常通過陽性離子維持細胞膜的穩定性。QACs(季銨鹽類化合物)是陽離子型表面活性劑和抗菌劑，可通過正電荷與細胞膜相互作用，其抗菌活性是N-烷基的功能。N-烷基賦予QACs親脂性特征，通過陽性氮基團與細菌細胞膜上酸性磷脂的結合，疏水端整合入細菌疏水膜的核心，在高濃度時，QACs通過形成混合膠束聚集來溶解疏水細胞膜成分（圖4）。總體來說，QACs發揮抗菌活性主要依靠破壞和變性蛋白和酶、破壞細胞膜整體性和使細胞內含物泄漏等^[8]。

圖4. QACs(季銨鹽類化合物)反應機理示意圖^[9]

a.QACs吸收后插入酸性磷脂分子層；b、c. 磷脂分子層流動性減弱，細胞膜產生空洞；d～f. 細胞膜中蛋白功能受損，細胞膜裂解，磷脂和蛋白溶解進QACs和膠團中溶解度增加。

如銅綠假單胞菌對季銨鹽的抗性就是由于細胞膜上脂多糖中脂肪酸的組成發生了變化，從而限制了季銨鹽進入細胞體內。脂肪酸的長鏈烴基是疏水性的非極性基團, 親水端暴露在膜的外表面，疏水端位于膜內。細胞膜上多不飽和脂肪酸上一個基團受到攻擊，導致碳鏈的氧化、斷裂及縮短，并釋放小的脂肪族產物 ,磷脂膜的這些改變引起細胞膜具有親水特性的核心部分結構改變^[10]。細胞膜中不飽和脂肪酸增加可增強膜的流動性，強化細菌對消毒劑的抗性；而細胞膜中陰離子磷脂減少或陽離子磷脂增加可使凈負電荷減少，同時脂質表面帶正電荷的基團阻礙了陽離子消毒劑與細菌表面的相互作用，導致細菌對陽離子消毒劑產生抗性^[11]。

在鼠傷寒桿菌、大腸桿菌和沙門氏菌中，內膜蛋白YejM依賴鎂離子而具有磷酸酶活性，可以調節外膜中甘油磷脂（PL）和脂多糖（LPS）的平衡，從而改變外膜通透性來抵抗消毒劑[^1,12]。

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