微生物耐藥性檢測方法

3.1 最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)檢測耐藥性

在對消毒劑的研究中，通過測定菌株消毒劑的最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)來判斷其耐藥性。一般認為，如果其MIC值高于標準菌株，則可認為該菌產生了消毒劑抗性。該方法操作較簡單，結果重復性高，為目前研究消毒劑抗性應用最多的方法。

表1 常用評價方法

3.2 耐消毒劑基因檢測

國內外目前也以檢測細菌的耐消毒劑基因來判斷對消毒劑的耐受性，具體方法包括實時熒光定量 PCR( real-time PCR)^[13]、多位點序列分型、質粒DNA圖譜分型技術等，也可以從生物大分子的角度研究耐消毒劑基因的表達，揭示耐消毒劑的機制^[2]。例如，可以利用質譜分析技術檢測耐消毒劑細菌外膜蛋白的表達變化，也可以通過色譜技術檢測耐消毒劑細菌表面的脂質或脂肪酸的分布，從而揭示細菌對消毒劑的抗性機制^[2]。

圖5 實時熒光定量 PCR機理^[13]

微生物對消毒劑耐藥性控制措施

微生物適應能力很強，科學發展的同時微生物也在不斷進化以適應環境改變，抵御各種滅菌措施，加強微生物對消毒劑的耐藥性認識，加強環境消毒的標準化，合理規范使用消毒劑，應從以下幾個方面應對消毒劑耐藥性的影響：

4.1 選擇合適的消毒劑作用濃度殺滅病菌

細菌在反復接觸低劑量或亞致死劑量消毒劑情況下，每次使用消毒劑會受到選擇壓力的作用，都可能促成細菌生態學的改變，就會更容易產生抗性，這也是細菌對消毒劑產生抗性的重要因素^[14]。在盡量保護環境的情況下，以超過MBC 的劑量，一次性將致病菌全部殺死為宜，對細菌產生殺滅作用，而不是抑制作用，從而減少耐消毒劑細菌的出現和傳播^[2]。

4.2 交替使用不同作用機理的消毒劑

有的消毒劑作用機理大致相同，如季銨鹽碘消毒液和聚維酮碘溶液消滅細菌的作用機理就基本一樣，即：碘鹵化菌體的蛋白質后會產生沉淀；細胞膜與表面活性劑易產生親和作用，將載有的碘與細胞膜、細胞質等物質相結合，使巰基化合物、肽、蛋白質、酶、脂質等氧化或者碘化最終達到了殺滅細菌的作用。而癸甲溴銨溶液與季銨鹽碘消毒液、聚維酮碘溶液的作用機理則有所區別，癸甲溴銨溶液屬于陽離子表面活性劑，可降低菌體表面張力增加菌體細胞膜的通透性，從而導致菌體中重要的酶和營養物質等的流失，使水滲入菌內，讓菌體溶解或者破裂^[15]。所以，規模化養殖場進行環境消毒時應盡量避免長期使用單一消毒劑。經常更換消毒藥的種類，以聯合使用多種處理方法協同作用來更徹底地消除有害微生物，可避免動物舍內的細菌產生耐藥性，提高消毒效果。

4.3 選擇合適的消毒劑

由于缺乏相關常識, 往往會錯誤地認為只要使用消毒劑消毒既能夠殺滅所有細菌, 造成了消毒劑的大量的濫用。因消毒劑的使用類型不當, 致使消毒劑本身對所要殺滅的細菌無殺滅作用，即相當于強化了細菌對該類消毒劑的適應性，從而增加細菌耐藥性的產生。所以，在使用消毒劑前應首先判定所處環境被何種細菌、病毒、疫病污染的程度或根據所要預防疫病的種類，有目的的選擇適合種類的消毒劑進行消毒^[16]。以下簡單列舉常用的一些消毒劑適用范圍：

表2 根據消毒對象選擇適宜類型的消毒劑^[17]

要進行密閉效果好的空的圈、舍、籠、房間的消毒，可選擇甲醛或戊二醛熏蒸的方法，密閉性較差的可選擇噴灑消毒方式。對耐腐蝕的物體表面可用噴灑的方法，對不耐腐蝕的物體用無腐蝕的化學消毒劑噴灑、擦拭等方式消毒。

4.4 加強耐藥性機制研究

關于細菌耐受消毒劑的抗性機理尚未完全清楚，微生物對消毒劑抗性機制以及調控措施的研究還在不斷探索中。加強細菌對消毒劑的抗性機理研究，有利于消毒劑的合理應用，對消除已出現的細菌對消毒劑抗性意義重大，同時有利于開發新的作用機制的消毒劑。在了解消毒劑殺菌機理基礎上，科學復配消毒劑，通過消毒劑與消毒劑的復方或通過消毒劑與助劑的復配，提高殺菌效果。

如戊二醛屬于高效消毒劑，但其不耐有機物干擾，而與季銨鹽類消毒劑復方，在戊二醛溶液中加入適量的表面活性劑可獲得多組分的配伍協同滅菌效果，可以顯著提高消毒效果。戊二醛與苯扎溴銨復方，苯扎溴銨與細菌細胞壁上的多磷脂反應，使細菌細胞壁上的肽變性，隨后戊二醛破壞細菌表面的蛋白受體，同時苯扎溴銨具有降低溶液界面張力、增強消毒劑在消毒物體表面上的潤濕作用，使戊二醛與病原體微生物充分接觸，提高戊二醛對菌體的滲透能力^[18]。二者聯合實現消毒滅菌過程的互補，充分發揮殺滅效果，避免了各自單獨使用時的限制條件。

圖6 戊二醛苯扎溴銨復方協同作用示意圖

討論與展望

現目前國內外對消毒劑耐藥性研究仍比較少，相關文獻報道并不多。微生物對消毒劑耐藥性機制較為復雜，且有些耐藥性是多種機制交叉作用/共耐藥^[19]的結果，但關于交叉/共耐藥機制的研究甚少，這也是未來研究重點。盡管目前尚未有明確研究發現消毒劑對微生物有顯著失效的現象，而現如今越來越多的研究顯示，在消毒劑長期壓力下，微生物對消毒劑的抗力增加體現在MIC和MBC提高，在實際使用需要提高原來常規使用濃度才能有好的消毒效果。在今后研究中仍應加強開展微生物消毒劑耐藥性、抗性相關基因及耐藥性產生機制的相關研究，深入探索微生物對消毒劑抗性的產生和傳播機理，為科學有效使用消毒劑、降低消毒劑耐藥性風險提供相關理論和數據支撐。

圖7 消毒劑的作用機制及可能誘發抗菌藥交叉/共耐藥機制^[19]

參考文獻

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[17]吳蕾,沈志勇,崔雪志,魯守偉,許傳田.五種不同種類消毒劑殺菌效果評估[J].家禽科學,2018(03):16-19.

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